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DNA电泳

DNA为碱性物质,在电泳(缓冲液pH=8)时带负电荷,在一定的电场力作用下向正极泳动。而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加,荷质比是一常数,故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。

电泳中影响DNA分子泳动的因素很多,主要分两方面:DNA分子特性和电泳条件。

⑴DNA分子大小   DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大,泳动也越慢,迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。

⑵DNA分子构型   对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量,因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同,最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率:超螺旋最快、线状分子次之,开环分子最慢。

⑶ 不同的胶浓度   对于同种DNA分子胶浓度越高,电泳速率越慢。不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别,浓度较稀的胶线性范围较宽,而浓的胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离(有时甚至用2%的凝胶),而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。

⑷电场强度   电泳时为了尽快得到实验结果,所用的电场强度约为5V/cm,这样的场强下虽能得到结果,但分辨率不高。在精确测定 DNA分子大小时,应降低电压至1V/cm。电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄,电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。实验中要根据需要选择合适电压,如对于DNA大片段的分离可适当选择较低电压进行(在Southern杂交中的DNA电泳),避免托尾现象的产生;而对于小分子DNA,由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊,可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。

⑸溴化乙锭   简称EB,电泳中的染色剂,具有扁平结构,能嵌入到DNA碱基对间,对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时,原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变,电泳迁移速度由快变慢;当嵌入的EB分子进一步增加时,DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变,这时电泳迁移速率又由慢变快。这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml,即电泳时所加的浓度。因此一般电泳可以忽略此因素,而对于特殊电泳,消除此因素影响可采用电泳后染色。

⑹电泳缓冲液   目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳:TAE、TBE和TPE。一般常用的DNA电泳选用TAE较多,其电泳时间较快,而且成本比较低,但是其缓冲容量较低,需经常更换电泳液。

琼脂糖凝胶

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溴酚蓝Bromophenol Blue 04805732 10 g MP客户可见 客户可见 请电话或邮件联系
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DNA Loading Buffer

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TRACKIT CYAN/ORANGE BUFFER 3 X 0.5 ML 10482028 3 X 0.5 ML invitrogen客户可见 客户可见 请电话或邮件联系
TRACKIT CYAN/YELLOW BUFFER 3 X 0.5 ML 10482035 3 X 0.5 ML invitrogen客户可见 客户可见 请电话或邮件联系
10X BLUEJUICE LOADING BUFFER 3 X 1 ML 10816015 3 X 1 ML invitrogen客户可见 客户可见 请电话或邮件联系
DNA电泳上样缓冲液,4X (BPB)GEL LOADING BUFFER, 4X (BPB) Amre-K945-5ML Amresco客户可见 客户可见 请电话或邮件联系
Blue/Orange Loading Dye, 6X G1881 3ml (3 × 1ml) promega客户可见 客户可见 请电话或邮件联系

变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)

变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)分析PCR产物,如果突变发生在最先解链的DNA区域,检出率可达100%,检测片段可达1kb,最适围为100bp-500bp。变性梯度凝胶电泳法原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶电泳中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时,DNA发生部分解链,电泳迁移率下降,当解链的DNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离。由于变性梯度凝胶电泳法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测,需要一套专用的电泳装置,合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹,以利于检测发生于高熔点区的突变。 DGGE变性梯度凝胶电泳主要应用于环境样品细菌、古细菌、真菌、真核微生物的多样性分析(土壤、水等样品无需培养,直接提取DNA扩增检测)动、植物体内外共生微生物的检测;食品微生物的检测;医学领域碱基突变的检测,杂合子检测等等。
 

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